单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通过提取样本单细胞核，然后分离、标记细胞核，在单细胞水平研究核基因表达检测的技术。为脑组织、心脏、肾脏等复杂组织或一些珍稀冻存样品提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理

细胞核的获得比细胞悬液的获得简单：

单细胞悬液制备过程是造成实验可变性的主要因素，细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq操作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高

适用的样本类型扩大：

抽提细胞核进行测序，对于新鲜样本解离成功率低的样本、或者是样本的收集难度大，收集周期长的样本（评估是否入组等）、或是细胞体积大，形状不规则的样本，都可以用snRNA-seq来解决

降低人为引入的转录偏差：

因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，避免了悬液制备过程引起细胞应激基因表达的情况，结果真实性提高

能够鉴定到的细胞类型更为全面和完整：

抽核过程中直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入的解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱

snRNA-seq会有检测到的基因偏少的风险：

虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核（snRNA-seq）测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当；但理论上来讲，缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用snRNA-seq每个细胞核中检测到的基因可能会有偏少的风险，不利于细胞亚型的鉴定

snRNA-seq对免疫细胞类型的获得不友好：

虽然snRNA-seq能够获得更加全面完整的细胞类型，但是对于某些细胞类型的获得比例不如scRNA-seq，主要表现为免疫细胞的缺失

研究目的：利用单细胞核RNA测序分析SCN在急性持续性光暴露后的转录反应；

样本信息：小鼠下丘脑视交叉上核（SCN）（光刺激后0/1/3/6小时）；

测序策略：10xGenomics平台，单细胞核测序（snRNA-seq）；

捕获细胞数：144,582个；

结论：在SCN中鉴定了三种对光线有反应的肽细胞类型:精氨酸加压素(AVP)、血管活性肠肽(VIP)和胆囊收缩素(CCK)。在每个细胞类型中，光响应亚群都被富集，以表达神经元PAS结构域蛋白4（Neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4, NPAS4）靶基因。此外，缺乏NPAS4的小鼠在恒定条件下有更长的昼夜周期，对光的相位响应曲线衰减，并减少光诱导的SCN基因表达。NPAS4是SCN中对光的正常转录反应所必需的，也是昼夜节律行为的光相转移的关键。

质量控制

质控是指通过一系列参数尽量排除双细胞、死细胞、多细胞的过程。基于质控后的数据进行的后续分析更准确

细胞分群及注释

细胞分群是依据基因表达量对细胞进行分类的过程，基于标志基因等方式，确定细胞类型是后续各种研究的基础

标志基因可视化

标志基因可视化气泡图常用于展示多个基因在不同细胞群中的平均表达水平，同时展示该细胞群中表达该基因的细胞所占的比例

细胞组成分析

细胞组成分析关注属于每个细胞特征群的细胞比例,该比例可能随着疾病的发生或发育进程而发生改变

细胞亚群分析

细胞亚群分析是指将关注的细胞拿出，再次进行分群的过程。细胞亚分群使得大家可以在更细的颗粒度研究科学问题，例如小鼠中性粒细胞可以被分为G0细胞、G1细胞、G2细胞等（Xie, X., Shi, Q., Wu, P., Zhang, X., Kambara, H., Su, J., ... & Luo, H. R. (2020). Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature immunology, 21(9), 1119-1133）

拟时序分析

伪时间分析（pseudotime analysis）是指通过计算细胞间基因表达量的渐变关系，预测所有细胞在一条或多条虚拟的时间线上的先后顺序，构建出细胞的发育或分化轨迹。常用于发育过程的样本，或药物处理后的时间序列样本，可以用于找到随时间变化，或在发育或分化节点起关键作用的核心基因

细胞时序变化：

细胞类型变化：

随伪时间变化的关键基因：

随伪时间变化的基因热图：

细胞通讯

细胞通讯（cell communication）是指细胞接收、处理和传递与环境和自身的信号的能力，它是每个生物体 （如细菌、植物和动物）中所有细胞的基本属性。CellPhone/CellChat可基于数据库&基因表达量推断不同细胞类型间存在的系统通讯关系

细胞间通讯强度：

配受体分析：

转录因子调控

转录因子（Transcription Factor, TF）是指通过结合基因上游特异核苷酸序列，进而调控该基因转录的蛋白质。多个转录因子协调，驱动基因表达，构成了复杂的转录因子调控网络，这些调控网络影响了细胞的增值、分化甚至疾病的发生。基于pySCENIC，我们可以推断单细胞转录组数据中存在的转录因子及其靶基因，并构建调控网络，以直观查看基因表达调控关系

RNA velocity分析

基于对RNA分子是剪接的还是未剪接（即仍包含内含子序列的新生RNA）的评估。RNA velocity能够预测给定细胞未来的基因表达状态

伪时间变化：

细胞类型变化：

inferCNV分析
InferCNV可以用于肿瘤单细胞RNA-Seq数据中鉴定大规模染色体拷贝数变异，例如整个染色体或大片段染色体的扩增或缺失

GSEA

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis/GSEA）通过评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献

GSVA
基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis / GSVA)，是一种非参数的无监督分析方法，主要用来评估转录组的基因集富集结果

单细胞核测序取样：

样本取材后直接擦干，放入防爆裂的管内之后，密封拧紧后浸入液氮，保持30s-1min，之后液氮或者-80°C保存

样本保存时间：

推荐在-80℃冰箱保存不超过3个月，3-6个月可以尝试，>6个月可以风险尝试

单细胞核测序上机要求：

合格后（RIN值>7）继续向下抽核，需要有3-5万干净的细胞核才可以保证1-2次上机（如果抽核以后有很多细胞碎片，需要有30万以上细胞核，才可以通过流式进行碎片去除）